感染新冠后往往会嗅觉失灵。关于SARS-CoV-2如何削弱或改变嗅觉目前还没有任何解释。一个悬而未决的问题是，嗅神经是否能为SARS-CoV-2提供一条进入大脑的通道。之前的演技表明，SARS-CoV-2进入细胞后不久，病毒进入基因（ACE2和TMPRSS2）在人和小鼠嗅觉系统中的表达。由此推断，嗅觉上皮(OE)中的敏感细胞类型可能是支持细胞，而不是嗅觉感觉神经元(OSN)。但是，令人费解的是，SARS-CoV和地方性HCoV-NL63也使用ACE2进入细胞，但并不常见导致嗅觉功能障碍。
最近发表在《Cell》标题为“VisualizingindeceasedCOVID-19patientshowSARS-CoV-2attackstherespiratoryandolfactorymucosaebutsparestheolfactorybulb”的文章表明，SARS-CoV-2不是嗜神经性病毒。支持细胞的暂时性支持不足会触发嗅觉功能障碍，嗅觉感觉神经元会受到影响而不会被感染。
在该研究的队列中，包括因新冠肺炎死亡的68名患者(图1B)，还包括15名对照组患者和2名（随后几个月去世）康复中的患者。这些已故患者有比较一致的特征：男性为主，患有多种并发症，最常见的是肥胖或超重、2型糖尿病和高血压。作者随后对已故患者和对照组的嗅觉组织进行了手术取样。
原位RNA杂交和免疫组化
用RNAscope对细胞中的RNA进行定位。结果表明呼吸道粘膜（RM）位于鼻腔内表面的大部分区域(图2A)。假复层呼吸上皮(RE)由厚厚的基膜从固有膜（LP）中分离出来。RE的主要细胞类型有纤毛细胞、杯状细胞和基底细胞。
FOXJ1（叉头框蛋白J1）编码一种参与纤毛发生的转录因子，是纤毛细胞的标志，纤毛细胞的纤毛不断地将覆盖的粘液扫到鼻咽。EPCAM（上皮细胞粘附分子）是一种细胞黏附分子，在呼吸道上皮（RE）中标记细胞，在LP中标记粘液腺及其导管细胞。粘蛋白MUC5AC是保护RM的凝胶形成糖蛋白，是杯状细胞的标志物，MUC5AC-IR信号也可识别分泌团粘液。
嗅觉黏膜（OM）是鼻黏膜的一个次要成分(图2B)。伪层化嗅觉上皮（OEs）的主要细胞类型是处于不同成熟阶段的嗅觉感觉神经（OSN）、非神经性支持细胞和基底细胞，基底细胞是在个体一生中再生OSN和支持细胞的干细胞。支持细胞可以被包括细胞角蛋白KRT8在内的几个标记物识别，它们在OE中的形态和位置是有特征的：它们横跨OE，顶部形成一层无核的层，逐渐变细，并将足突延伸到一层薄基板上，从而将OE与LP分开。嗅觉标记蛋白(OMP)是OSN成熟的经典标志。如图所示，嗅觉突触含有OR5A1的斑块，OR5A1是β-紫罗兰酮的主要受体，而紫罗兰酮是食品和饮料中的一种关键香气。嗅球（OB）位于颅腔内(图2C)。它接受来自嗅丝的左侧的输入，即穿过筛状筛板上几十个孔的OSN轴突束。TUBB3是微管的组成部分，是神经元和轴突的经典标记。TUBB3-IROSN轴突在OB内凝聚成球。OB的表面紧密地覆盖着软脑膜层，对生长抑素受体2（SSTR2A）是IR的。另一层软脑膜层是蛛网膜，一种连接硬脑膜的蜘蛛网状结构，硬脑膜是靠近头骨的坚硬的外层脑膜层。脑脊液在软脑膜和蛛网膜之间持续循环。
由于SARS-CoV-2是正义RNA病毒，如果出现负义RNA，表明病毒正在复制，不存在于病毒粒子中。作者使用了7个RNAscope作为探针，检测负义RNA。它们分别是SARS-CoV-2-N(N斑),SARS-CoV-2-S(刺突;S斑),SARS-CoV-2-M(膜;M斑),SARS-CoV-2-orf1ab(开放阅读框1ab;orf1ab斑a),SARS-CoV-2-N-sense(N-sensepuncta),SARS-CoV-2-S-sense(S-sense斑),和SARS-CoV-2-orf1ab-sense(orf1ab-sense)，发现斑点出现在核周。为了给嗅裂黏膜标本的检查提供合适的背景，作者首先对RM标本进行了检查(图3)。在68例COVID-19病例中发现30例(44%)的RM中存在病毒。除了COVID#29，接受实体器官移植的免疫抑制患者在确诊后29天死亡。其余38例的RM、OM和OB均未检测到SARS-CoV-2puncta。
图3A-3C为对照病例#12的RM切片共焦图像。纤毛细胞弥漫地充满KRT7-IR信号并含有FOXJ1斑点，而细胞角蛋白Krt5/6的IR信号标记为细胞的基底层，描绘了LP中的RE（图3A），EpCAM-IR标记上皮细胞，而MUC5AC-IR信号标记产生粘蛋白的细胞并识别粘液斑块(图3B)。ACE2-IR信号在RE的管腔表面形成一条不连续的薄带，TMPRSS2信号在RE各处形成点状(图3C)。
在新冠病人#7的RE中，核衣壳IR信号弥漫地充满了一排不间断的顶端细胞（图3d和3E）。对于这位确诊后78小时死亡的患者来说，感染的时间线非常明确，在此之前，3天和6天前核酸检测阴性。与感染的急性期一致，核衣壳-IR细胞含有核周orf1ab-sense斑点结构。在COVID#7中核衣壳-IR细胞中核周N-sense斑点与orf1ab-sense斑点聚在一起(图3F)，在COVID#27中orf1ab密集分布(图3G)。在COVID#51中，核周N-sense斑点与M、FOXJ1斑点聚在一起(图3H)。在COVID#39中，单个纤毛细胞内的核周orf1ab-sense斑点与FOXJ1点聚在一起(图3I)。在COVID#7的KRT7-IR细胞中，核周S-sense斑点与FOXJ1斑点聚在一起(图3J)。
在30例提供信息的病例中，有4例LP腺管内的细胞被感染。在COVID#29、#63和#67中，只有导管被感染，而在COVID#60中，RE和导管都被感染。LP港腺管衬里的KRT8-IR细胞密集分布在COVID#29中的N斑(图3K)和COVID#63中的orf1ab-sense斑(图3L)中。最初将COVID#63作为对照病例，在死亡前82小时采集的鼻咽（NP）拭子的PCR结果为阴性，但作者在尸检时采集的拭子的PCR检测呈阳性。COVID#63在作者的队列中从诊断到死亡的间隔时间最短。总之，RM是SARS-CoV-2的主要感染部位，代表了一大片易受病毒入侵和复制的细胞。
年末，变种B.1.1.7进入比利时，并在比利时第三波新冠肺炎疫情期间迅速成为主导谱系。B.1.1.7后来被称为Alpha变异体，其特点是具有更高的传播率和更高的病毒载量。S中编码氨基酸HV的6个核苷酸的缺失是Alpha变体的特异性，非结构蛋白nsp6的orf1ab编码SGF的9个核苷酸缺失存在于Alpha、Beta和Gamma变体中。作者使用BaseScope的定制探针设计了一种显色分析，BaseScope是RNAscope平台的一个版本，专门用于细微突变。
通过这种方法，作者获得了35例新冠肺炎患者的特异性PCR或序列变异数据，其中包括COVID#60(感染非阿尔法家系株)和COVID#68(感染阿尔法)。在COVID#60的RE(一名肿瘤疾病活动期患者，确诊40小时后死亡)中，含有FOXJ1斑的一小部分细胞弥漫地充满核衣壳-IR信号，并且大多数这些细胞都含有核周orf1ab-sense斑。在COVID#68的RE(一位肿瘤学状况活跃的患者，确诊后5天死亡)核周S-sense斑与FOXJ1斑聚集在核衣壳-IR细胞中(图4A)。野生型或缺失型的两个BaseScope探针的混合物分别在COVID#60或COVID#68的RE中形成蓝绿色或红色沉淀物(图4B)。两个针对orf1ab野生型或缺失形式的BaseScope探针的混合支持这种二进制基因分型(图4C)。
SARS-CoV-2感染嗅上皮中的支持细胞
接下来，作者对嗅裂粘膜标本进行了分析(图5)。作者通过ANO2、CNGA2、GNAL、GNG13、OMP和OR基因，TUBB3-IR信号等神经元标记点的表达来严格定义OM。作者在30例(20%)病例的OM中检测到6例(20%)SARS-CoV-2点和核衣壳IR信号。作者确定支持细胞是嗅觉上皮（OE）的主要靶细胞类型。
图5A和图5B显示了对照病例#4的OM。支持细胞弥漫地充满KRT8-IR信号，并含有TMPRSS2点，四个相邻的OSN具有用于OR基因OR5A1、OR5AN1、OR7C1和OR11A1探针池的斑(图5A)。ACE2-IR嵴状条纹覆盖着一排交织的KRT8-IR支持细胞和TUBB3-IROSN(图5B)。COVID#22在确诊26天后死亡，在任何组织样本中都没有检测到SARS-CoV-2斑(图5C)。GPX3斑编码谷胱甘肽过氧化物酶，从顶端到基部标记支持细胞和LP中的鲍曼氏腺细胞。ANO2的斑编码嗅觉信号转导通路中的氯离子通道，标记OSNs的中间层。KRT5/6-IR信号标记细胞的基底层。
一个信息量很大的病例是COVID#8，他在诊断后4天死亡。TUBB3-IR细胞(OSN)不含核衣壳-IR信号，支持细胞含有UGT2A1斑点(图5D)。N斑点弥漫充满大量的支持细胞跨越宽度的OE从顶端到基部；有趣的是，KRT8-IR信号可以识别未感染的支持细胞斑块，而感染的支持细胞KRT8-IR信号低或阴性。N斑点密集排列，呈典型的支持带细胞形状(形似葡萄酒杯，扭曲柄接触基板)，受感染的支撑细胞顶端较宽的部分与未受感染的支撑细胞混杂，含有UGT2A1斑点，顶端有支撑细胞标志物ERMN的IR信号。这种感染的支持细胞对抗原标记的斑点或IR信号低或阴性，这表明SARS-CoV-2诱导的宿主mRNA的衰退和抑制宿主蛋白翻译。
COVID#8嗅觉上皮的空间全转录组分析
作者假设在感染的急性期，支持细胞的感染会间接影响OSN中OR基因的表达。利用完整的转录组图(WTA)对18,个人类转录本进行了GeoMx数字空间分析。COVID#8最适合进行这种分析，因为成熟的OSN数量丰富，OE的连续长度为几毫米，感染部位具有空间特异性。
用RNAscope探针对载玻片进行KRT8/18和泛pan-KRT的荧光染色。然后将玻片与WTA探针和orf1ab和S的插入物杂交。根据来自S斑点的荧光信号的强度，作者在OE中选择了17个感兴趣的区域(AOI)：10个是高病毒载量(ORF1ab高)，7个是低病毒载量(ORF1ab低)(图6A)。放大后显示了两个AOIs：AOI13包含个原子核，面积为25,μm2；AOI7包含个原子核，面积为38,μm2(图6B)。这两种类型的AOI在细胞核计数上没有显著差异(图6C)。
每个AOI被单独紫外光照射以光裂解WTA探针以进行收集和测序。orf1ab在高ORF1ab与低ORF1abAOIs的归一化表达计数与作者对共焦扫描的视觉判断非常吻合(图6D)。S和orf1ab计数的Pearson相关系数为0.(图6E)。对在至少20%的AOI中检测到的个基因的差异表达建模显示，在高ORF1abAOI中，支持细胞标记GPX3、KRT8和KRT18的归一化表达计数显著减少，而OSN标记ANO2和GNG13的归一化表达计数显著增加(图6F)。作者通过RNAscope在相邻切片中鉴定的4个OR基因OR5A1、OR5AN1、OR7C1和OR11A1都在WTA图谱检测到的26个OR基因中。总之，空间全转录图谱的玻片内方法显示COVID#8中高病毒载量与低病毒载量的OE斑块的OR基因表达水平没有差异。
SARS-CoV-2可以到达嗅球周围的软脑膜层，但保留了其实质
作者没有发现病毒入侵OB实质的证据。令人惊讶的是，在30例信息丰富的病例中，有11例(37%)在OB周围的软脑膜层中发现了病毒RNA(图7)。在COVID#16(确诊后8.5天死亡的活跃肿瘤患者)中，整个OB矢状面图像显示SSTR2A-IR信号标记了脊膜和蛛网膜，TUBB3-IR信号标记了进来的OSN轴突和OB神经元(图7A)。高倍图像显示N斑点位于紧挨着OB的软脑膜一侧(图7B)。在同一个OB的相邻切面，软脑膜段内密集排列的N斑点与丰富的核衣壳-IR信号一起出现，这可能反映了游离病毒粒子(图7C)。在另一张切片中，S斑出现在内皮细胞PECAM1点状的斜切血管内(图7D)。在COVID#7中，N斑点出现在部分脱落的SSTR2A-IR软脑膜条带中(图7E)。在COVID#27(确诊93小时后死亡)中，密集的M斑点出现在覆盖OB的软脑膜和PECAM1点的血管范围外(图7F)。在COVID#60(确诊40小时后死亡的活跃肿瘤患者)中，OB附近的软脑膜样本，包括硬脑膜过渡区，包含丰富的N和S斑点，散在SSTR2A-IR信号中(图7G)。这表明，SARS-CoV-2似乎不是一种嗜神经病毒，因为它不感染OSN和OB神经元。
总结
在这里，作者以病毒为中心看待新冠肺炎，从SARS-CoV-2攻击人类嗅觉系统的角度出发。作者确定支持细胞是OM的主要靶细胞类型，未能找到OSNs和OB实质感染的证据，并在OB周围的软脑膜层中发现了病毒RNA。了解人类支持细胞以多种方式正常支持嗅鞘的机制可能会为新冠肺炎预防、缓解或治疗嗅觉功能障碍的治疗干预提供线索。聚光灯应该聚焦在那些无名英雄的嗅觉上--卑微的支持细胞。
