特别综述
本文是由复旦大学郑煜芳研究员发表FASEBJ上面的综述论文“Organoidsasanewmodelsystemtostudyneuraltubedefects”神经管是胚胎发育的第一个至关重要的结构。它是中枢神经系统的原基；因此，神经管的正确形成对发育中的生物体至关重要。神经管缺陷（NTD）是胚胎发育早期神经管闭合失败引起的严重先天性缺陷。NTDs的发病机制是复杂的，即使经过几十年的研究，仍然没有完全理解。研究人类胚胎中神经管的体内形成过程在伦理上是不可能的，但一项涉及神经管类器官创建的新技术可作为研究人类神经管形成和NTD发生的优秀模型系统。在此，我们回顾了神经管形成过程的最新文献，NTDs研究的进展，特别是使用神经管类器官来模拟NTDs病因的细胞和分子机制的令人兴奋的潜力。
INTRODUCTION
神经管缺陷（NTD）是人类最常见的结构畸形之一，影响中枢神经系统（CNS）的发育。NTD被认为是早期胚胎发生期间神经管闭合（NTC）失败的结果。根据前-后（A-P）轴异常NTC发生的不同部位，NTD可分为许多亚型，包括无脑、颅轴裂和脊柱裂。据报道，全世界新生儿NTD的患病率从0.3/到.4/不等。1中国NTD的估计患病率在不同地区差异很大，从中国北方的31.5/到中国南方的5.83/不等。3尽管经过几十年的研究，人类NTD的病因尚未明确诠释。造成这一知识差距的主要原因之一是缺乏研究人类胚胎早期发育事件的合适模型。4幸运的是，新开发的类器官培养系统提供了一种新的三维（3D）模型系统，用于研究和更好地理解体外系统中人类神经管的发育。这种新模型被称为神经管类器官。本文综述了神经管的形成和神经管类器官培养系统的研究进展，重点介绍了神经管类器官培养系统及其在神经管类器官培养研究中的潜在应用。
NEURALTUBEDEVELOPMENTANDNTDS
神经管是中枢神经系统的原基，它的正常发育对胚胎的生长和形成至关重要。神经管中的细胞在其基因组中有不同的细胞命运，它们沿着身体轴分化。最后，前部形成大脑，其余部分进入脊髓。神经管的中央腔成为未来的心室和中央管。
神经管的形成始于外胚层胚层的分化。受来自脊索的刺猬声波(Shh)信号的诱导，上覆的外胚层分化为神经外胚层，这个扁平的细胞片现在被称为神经板。5,6神经板的两侧逐渐升高形成神经外胚层褶皱。神经褶皱向上并向中线折叠以完成神经管闭合(NTC)。7骨形态发生蛋白(BMP)和Wnt信号通路在神经管的早期分化中也具有重要功能。8-11NTC开始在胚胎的中颈部分，从而在胚胎的颅面形成前神经孔和在尾部区域形成后神经孔。人类前神经孔的闭合发生在受精后第25天左右，而后神经孔的闭合发生在第27天左右。通常在胚胎发生的第四周结束时，NTC已完成。
上述神经形成过程称为初级神经形成，它是脊椎动物中两种主要的神经形成模式之一。另一种模式称为次级神经形成。12主要区别在于神经板折叠并内陷进入体内并与表面外胚层分离，在初级神经形成中形成下面的中空管；而间充质细胞的聚集体形成实心索，该索经历间充质-上皮转化（MET）并形成空腔以在次级神经形成中形成中空管。大多数脊椎动物在前部区域经历初级神经形成，在尾芽周围的后部区域经历次级神经形成。初级或次级神经形成过程的失败可能导致具有不同表型的NTD。
TheoccurrenceofNTDs
正常NTC的失败将导致许多开放性NTD，包括无脑、颅脊裂、脊膜脊髓膨出和脊髓分裂等。此外，二次神经发育的失败可导致闭合性NTD，如隐性脊柱裂和脊髓囊肿。13遗传和非遗传因素在NTDs的病因中都起着重要作用。
研究人员已经确定了多种遗传因素，似乎有助于人类NTD的发生。例如，我们最近对三个独立的NTD队列（总共例）进行的研究表明，与基因组项目的对照组相比，NTD队列中的单例功能丧失变体数量显著增加。14此外，利用脊椎动物模型，确定了一些增加NTD患病率的候选基因。迄今为止，已经鉴定出多个小鼠基因，这些基因的异常表达是导致NTD的原因。8,15其中一些基因在脊椎动物中高度保守，16,17表明这些基因的突变可能与人类NTD的潜在风险有关。先前的研究已经证实，某些遗传和染色体结构变异确实与NTD风险增加相关。18-23然而，这些遗传变异和NTD之间的基因型-表型关系是复杂的。在几种不同的NTD亚型中观察到一些变异，而在健康个体中也发现了一些变异。24这些变异的功能变化以及它们如何导致NTD在很大程度上仍然未知。
除遗传因素外，还有多种非遗传因素也有助于NTDs的病因，25包括：环境*物、26,27种药物、28,29和母亲因素，30,31如母亲肥胖、32例母亲糖尿病、33,34和母亲营养状况，尤其是叶酸缺乏的证据，35，仅举几个例子。因此，NTD的发生很可能是复杂事件组合的结果，涉及遗传和非遗传因素。
AnimalmodelsforNTDs
模式生物的使用在发育生物学研究中一直扮演着重要的角色。利用小鼠、小鸡、爪蟾和斑马鱼等动物模型，研究人员成功构建了许多NTD模型，以研究失败NTC的潜在机制。37-40许多转基因小鼠模型已经被建立起来进行研究NTD，最近发表的许多论文对此进行了评论。15,25,41-43
然而，这些动物模型不能完全代表人类NTD，因为它们的基因组不仅与人类不同，而且不同模型物种的神经管形成也不完全相同。例如，NTC的过程在人类、小鼠、鸡和非洲爪蟾中有所不同，特别是在起始闭合点的数量、闭合过程的时间和顺序上（图1）。尽管小鼠胚胎中的NTC与人类胚胎中的NTC非常相似，但小鼠和人类的NTC之间仍存在一些差异。老鼠有三个起始闭合点，而人类只有两个起始闭合点（图1A，B）。人类胚胎的起始闭合点相当于小鼠的闭合点1和3。44如图1B所示，小鼠闭合点1位于后脑/颈部边界，而闭合点2位于前脑/中脑边界。闭合点1和2都是双向的。闭合点3位于神经管的最前端，仅在后方闭合。NTC的压缩过程从闭合研究点1和2开始，然后沿闭合点的两个方向扩展。同时，闭合点3从该部位向闭合点2尾端移动。8鸡胚也只有两个初始闭合点，分别位于未来的中脑和后脑/颈部边界，并且这两个部位都经历了双向闭合过程（图1C）。非洲爪蟾的神经管闭合完全不同，因为它几乎同时发生在整个身体轴45上（图1D）。
因此，脊椎动物模型在体内完全复制人类神经管的精确发育事件以及人类NTD的病因方面存在局限性。然而，出于伦理考虑，不可能在体内进行人类神经管发育研究。幸运的是，随着一项新兴技术——类器官培养的广泛应用，研究人员现在可以利用人类多能干细胞（hPSCs）构建神经管的3D细胞模型。这种三维细胞模型被称为神经管类器官。神经管类器官中的细胞聚集体模拟神经管的体内细胞组成。这种新的模型系统使得利用体外培养系统研究人类神经管的发育成为可能。我们将在以下章节中总结这种新方法及其在NTD研究中的应用。
NEURALTUBEORGANOIDSCULTURE
类器官被定义为由多能干细胞或器官祖细胞产生的3D细胞聚集体，由器官特异性细胞类型组成，这些细胞类型通过细胞分类和空间限制的直线承诺自组织，类似于体内。46,47类器官可从胚胎干细胞（ESCs）、成人干细胞（ASCs）和诱导多能干细胞（iPSCs）中获得。在一定的细胞外支架培养条件和信号因子下，这些细胞通过自组织机制被诱导重新排列，形成适当的细胞聚集体。类器官可以代表相应器官的表型和遗传特征，并且能够在整个体外培养过程中保持这些特征。最重要的是，器官发生中的两个关键事件在类器官形成过程中被忠实地再现，即细胞分类和空间限制的谱系承诺。46这些特性使类有机物成为一个更合适的模型，不仅可以模拟体内器官发生过程，还可以模拟器官和组织的生理或病理状态。为了在体外研究人体许多不同器官的功能，在培养系统中成功构建了与不同器官对应的类器官，包括大脑、48个视网膜、49个心脏、50个肝脏、51个肾脏、52个胃、53个和肠。54由于类有机物可由单个IPSC生成，因此类有机物已被用于临床研究。55,56
与其他一些器官相比，神经管类器官的发展相对较晚，尽管神经管是一个相当简单的器官。它是在大脑类器官产生之后发展起来的。48一般来说，神经管类器官培养基于PSC在3D细胞外基质条件下的自组织能力和在适当时间点传递的外源信号因子，以激活相应的信号通路。科学家已经成功地从人类和小鼠的PSC中产生了神经管类器官。
Culturingmethods
为了形成一个合适的神经管类器官，培养方法非常重要，必须严格控制。我们在表1中总结了神经管类器官方法的发展。尽管第一个神经管类器官57是在大脑类器官发展之后培养的，48类似的想法可以追溯到年，当时Sharon和同事培养悬浮胚胎体（EBs）以研究原肠胚组织。年，Meinhardt及其同事在Matrigel中利用小鼠胚胎干细胞成功培养了第一个神经管类器官。57两年后，Ranga等人使用类似的方法研究3D微环境如何影响神经管类器官的D-V模式形成。59他们在培养系统中加入bFGF以促进神经中胚层发育。随后，发表了几篇论文，利用嵌入Matrigel60或悬浮培养基中的hPSCs构建“脊髓类器官”，以诱导EB样结构。61,62科学家还添加了更多的添加剂来诱导某些细胞的命运，如脊髓运动神经元60或D-V型脊髓样组织。61在过去的两年中，神经管类器官的培养方法有了更多的进展。Zheng和同事开发了一种凝胶-3D方法，其中2%的液体形式的Geltrex被添加到诱导培养基中，以创建一个3D细胞外基质（ECM）环境，使人胚胎干细胞生长成神经管细胞63（也如图2所示）。这种方法可以生成有图案的神经花环。Veenvliet及其同事培养了具有“躯干状结构（TLS）”的类器官，这种结构模仿后神经管和双侧体节。64他们首先让MESC聚集形成原肠胚，然后将这些原肠胚嵌入5%的基质凝胶中，以进一步支持类器官发育。有趣的是，从Tbx6-/-mESCs开始的神经管类器官也在分子水平上重新获得了一些体内表型。
由于培养基质和培养基对于神经管类器官培养至关重要，我们将在以下章节中继续讨论这两部分。
Culturingmatrix
培养基质用于支持类器官的3D生长，并增加细胞-细胞和细胞-基质相互作用，从而促进ESC形成功能性和器官样结构。65，因为类有机物的生长取决于不仅生物材料，而且在环境方面，培养基质的许多方面都会影响类器官培养的结果。这些方面包括是否使用培养基质、如何使用培养基质以及系统中使用的培养基质的性质。目前有三种主要类型的培养基质，包括：（a）来自生物体的基底膜提取物（如Matrigel、Geltrex），（b）纯化的基底膜提取物（如层粘连蛋白/恩他ctin复合凝胶），以及（c）合成基质（如PEG基凝胶）。例如，zheng和同事使用Geltrex63；Ranga及其同事研究了含有不同成分的PEG基凝胶59；Meinhardt和同事们在他们的研究中成功地应用了这三种培养基质。57有两种主要方法处理如何应用培养基质。一种方法是在液体状态下将起始细胞与培养基质混合，然后使混合物固化。使用这种方法，细胞凝固后嵌入培养基质中。在另一种方法中，将起始细胞直接接种在固体培养基质的表面上，并添加与液体基质混合的液体培养基以覆盖细胞。
Culturingmedium
神经管类器官的基本培养基是N2B27培养基。N2B27培养基以N2和B27补充剂命名。其基本成分为DMEM/F12和神经基础培养基，体积比为1:1，并配有B27补充剂、N2补充剂、β-巯基乙醇和其他生长因子，这些生长因子因其独特的应用而异。DMEM/F12培养基是一种基本培养基，可以维持多种不同的哺乳动物细胞类型。神经基础培养基和B27补充剂用于维持胚胎神经细胞的生长和成熟，无需星形胶质细胞饲养层。补充氮气可以维持神经元。最后，使用β-巯基乙醇控制培养物的氧化还原环境。
用N2，B27培养基培养的神经管类器官可以形成基本的管腔结构。然而，它的结构和细胞组成远没有体内的神经管复杂。因此，添加外源信号以生成类有机物的正确模式形成。最常用的添加剂是维甲酸（RA）和Shh，以实现适当的D-V模式57,63（图2）。添加其他添加剂以改善类有机物的生长和诱导模式。例如，Wnt信号是区分A-P模式所必需的。66因此，应用GSK3i（Wnt信号通路的激活剂）可以增强神经管类器官的后向分化。67此外，同时应用几种不同的信号分子可以诱导神经管类器官模拟神经管的特定区域，因此GSK3i-SHH组合可以诱导具有前脑特定模式（NKX2）的神经管类器官。1/6）。67
Comparisonwithneuraltubeinvivodevelopment
建立类器官以模拟体内器官或组织。以前，基于以下特征分析了神经管类器官和体内神经管之间的相似性：整体结构、神经命运承诺、顶端-基底极性、A-P和D-V模式。
评估神经管类器官特征的第一个也是最简单的方法是直接在光学显微镜下观察整体结构。文献中报道的大多数神经管类器官都有一个类似于在体内发育的神经管的腔。类器官的腔体呈囊状，因为类器官几乎是球状结构，而神经管在体内形成长柱状腔体。
其他类器官特征通过使用特定标记的免疫荧光染色观察到，这将在下面详细讨论。与体内发育过程类似，许多特征都依赖于时间。因此，在描述神经管类器官的特征时，通常会强调时间信息。
Cellfate